نام و نام خانوادگی: سحر سیاوشی
عنوان پایان نامه: ردیابی مسیردر ربات چهارچرخ مکانوم با استفاده از کنترل کننده پیش بین مدل تابعی
رشته تحصیلی: کارشناسی ارشد زیست‌شناسی -علوم سلولی مولکولی
مقطع تحصیلی: کارشناسی ارشد ناپیوسته
استاد راهنما:دکتر کیانوش درمیانی

چکیده:

مقدمه: فاکتور رشد شبه انسولین 1 انسانی پلی پپتیدی غیرگلیکوزیله است که دارای 70 اسیدآمینه و سه باند دی سولفید درون زنجیره ای می باشد. IGF-1 واسطه اصلی رشد هم در دوران جنینی و هم در دوران پس از تولد است. تا به امروز مطالعات زیادی انجام شده که در آن ها گونه های جدیدی از IGF-1 نوترکیب با هدف افزایش پایداری، فعالیت و در نتیجه اتصال بهتر یه گیرنده  تولید شده است. مشکل اصلی در تولید IGF-1 نوترکیب کمبود بازده تولید این پروتئین، خالص سازی پیچیده و هزینه بالای تولید آن می باشد.
مواد و روشها: در این مطالعه دو حامل بیانی طراحی و ساخته شدند. در حامل بیانی اول دو کاست بیانی در دو جایگاه کلونینگ حامل pET-Duet کلون شدند. یکی از کاست ها جهت بیان پروتئاز TEV (Tobacco etch virus) محلول متصل به برچست GST تحت کنترل پروموتر tac طراحی گردید. کاست دوم برای بیان یک پروتئین همجوش تحت کنترل پروموتر T7 طراحی شد که به ترتیب شامل توالی برچسب حلالیت تیرودوکسین متصل به یک جایگاه برش پروتئاز TEV و پروتئین IGF-1 دارای برچسب هگزا هیستیدین (Trx-rsTEV-6Histag-IGF-1) بود. این حامل pET-Duet (1X) نامیده شد. در حامل بیانی دوم علاوه بر کاستهای ذکر شده کپی دیگری از کاست IGF-1 بعد از کاست اول کلون شد به گونه ای که یک توالی واسط (Linker) به نام ZY ما بین دو توالی بیانی IGF-1 قرار گیرد. این حامل pET-Duet (2X*) نامیده شد. میزان بیان پروتئین توسط حامل اول در دو سویه Shuffle و Rosetta-gami مقایسه شد و با توجه به برتری مشاهده شده در اشرشیا کلی Shuffle، برای ادامه آزمایش ها این سویه مورد استفاده قرار گرفت. سپس شرایط بهینه برای بیان TEV پروتئاز و پروتئین همجوش Trx-rsTEV-6Histag-IGF-1 در سویه Shuffle به دست آمد. همچنین میزان بیان پروتئین IGF-1 توسط دو حامل در سویه Shuffle در شرایط بهینه بیان با هم مقایسه شد.ند. پس از آن به منظور خالص سازی پروتئین نوترکیب IGF-1 از یک روش ساده و تک مرحله ای با استفاده از رزین نیکل استفاده شد. به علاوه نتیجه حاصل از وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی اختصاصی IGF-1، صحت پروتئین تولید شده را تایید کرد و در نهایت عملکرد IGF-1 با توجه به اثر آن بر روی میزان تکثیر سلول های NIH3T3 و میزان گسترش کومولوس های گاوی ارزیابی شد.
نتایج و بحث: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که TEV پروتئاز به خوبی جایگاه برش اختصاصی خود را بین Trx و IGF-1 در سلول های هر دو سویه شناسایی و هضم کرد. با این حال، میزان بیان و عملکرد این پروتئاز در دو سویه باکتریایی تفاوت قابل توجهی را نشان داد. TEV پروتئاز در سویه Shuuffle به میزان بیشتری نسبت Rosetta-gamiبیان شد و به شکل مؤثری پروتئین همجوش را برش داد بطوریکه تقریبا تمام IGF-1 را پس از تولید از برچسب Trx جدا کرد. در مقابل در سویه Rosetta-gami نه تنها میزان بیان TEV پروتئاز به مراتب کمتر بود بلکه میزان فعالیت برشی آن در مقایسه با پروتئین تولید شده در سویه Shuuffle ضعیف تر بود بطوریکه بخش عمده پروتئین IGF-1 پس از تولید همچنان به Trx متصل باقی ماند. در نتیجه سویه Shuffle به عنوان سویه بیانی برتر در این مطالعه انتخاب شد و شرایط بهینه بیان IGF-1 در این سویه بدست آمد که عبارت بود از غلظت 1/0 میلی¬مولار IPTG در دمای 30 درجه سانتی گراد برای مدت زمان 6 ساعت. فعالیت بیولوژیک IGF-1 نوترکیب با توجه به تاثیر آن بر تکثیر سلول¬های NIH3T3 و گسترش کومولوس های گاوی در مقایسه با یک نمونه IGF-1 تجاری ارزیابی شد. نتایج نشان داد که این پروتئین از لحاط عملکرد بیولويیک همانند نمونه استاندارد فعال می باشد.
نتیجه گیری: در این مطالعه یک روش کارامد برای تولید پروتئین IGF-1 نوترکیب به فرم محلول و فعال در سلول های باکتریایی سویه Shuffe ارائه شد که در آن پروتئین تولیدی در نهایت با یک روش ساده و مقرون به صرفه بدون هیچ برچسب حلالیتی با استفاده از رزین نیکل از سلول های باکتریای خالص سازی شد.

کلیدواژه: فاکتور رشد شبه انسولین 1 انسانی، پروتئاز TEV، سویه بیانی Shuffle، پروتئین نوترکیب

تاریخ دفاع: پاییز 1398