ریحانه خیام‌ عابد،کارشناسی ارشد رشته‌ی زیست‌شناسی-سلولی مولکولی، دکتر فرشاد همایونی مقدم، 1398

نام و نام خانوادگی:ریحانه خیام‌ عابد
عنوان پایان نامه: بررسی نقش modified-mRNA اختصاصی برای Nkx2.2 بر روی تمایز سلول‌های بنیادی به رده اولیگودندروسیت
رشته تحصیلی: کارشناسی ارشد زیست شناسی گرایش سلولی و مولکولی
مقطع تحصیلی: کارشناسی ارشد ناپیوسته
استاد راهنما: دکتر فرشاد همایونی مقدم

چکیده:

مقدمه: ژن‌درمانی امروزه به عنوان یک روش درمانی موثر مطرح شده است و تحقیقات در زمینه ارائه روش‌های ایمن‌تر برای ژن‌درمانی رو به توسعه می‌باشند. از طرفی سلول‌درمانی نیز یک روش درمانی جدید و در حال گسترش می‌باشد. تلفیق دستکاری ژنتیکی ایمن و سلول‌درمانی منجر به ارائه روش‌های جدیدتر درمانی خواهد شد که در آن‌ها می‌توان سلول‌های مورد نیاز برای ترمیم بافت‌ها را در خارج از بدن تولید نموده و سپس به بدن پیوند زد. ژن‌های بسیاری می‌توانند برای این منظور مورد استفاد قرار بگیرند. در این مطالعه ما ژن Nkx2.2 را انتخاب کرده‌ایم که به دلیل نقش آن در تمایز اولیگودندروسیت‌ها، تحریک رشد زوائد نورونی، بازسازی غلاف میلین و همچنین امکان کاربرد آن در تولید سلول پیش‌ساز اولیگودندروسیتی (OPC) در آزمایشگاه قابلیت‌های فراوانی دارد. جهت القاء تمایز سلول‌های بنیادی پیش­ساز عصبی به اولیگودندروسیت­ها، روش­های متنوعی با کارایی­های متفاوت وجود دارد که عمدتا در آنها از حامل‌های ویروسی و غیرویروسی، ریزمولکول‌ها و پروتئین‌های القاگر استفاده می­شود. اما عدم کارآمدی کامل هرکدام از این روش‌ها مانع از تولید مطلوب آزمایشگاهی سلول‌های اولیگودندروسیت به منظور مصارف درمانی شده است. یکی از راهکارهای رفع این چالش، استفاده از In Vitro Transcribed modified mRNA (ivt-mmRNA) جهت القای مستقیم بیان پروتئین در سلول بدون دستکاری ژنتیکی می­باشد. بنابراین در این مطالعه برای اولین بار از ivt-mmRNA جهت افزایش بیان فاکتورهای رونویسی و در نتیجه القای تمایز سلول‌های بنیادی عصبی موشی (mNSC) به رده اولیگودندروسیت استفاده شد.

روش‌ها: ابتدا به منظور رفع چالش‌های پیش رو در واکنش IVT و دستیابی به ivt-mmRNA با کیفیت و همچنین بررسی کارایی دقیق این ابزار در القاء بیان پروتئین، ivt-mRNA-EGFP (EGFP^IVT) در شرایط آزمایشگاه ساخته شد. سپس سلول‌های HEK293T و mNSC توسط mmRNA تولید شده ترانسفکت شدند و بیان EGFP در آنها مشاهده شد. در مرحله بعد ivt-mmRNA-Nkx2.2 (Nkx2.2^IVT) سنتز و پس از ترانسفکشن به سلول‌های HEK293T، کارایی آن جهت بیان پروتئین Nkx2.2 سنجیده شد. در قسمتی دیگر از مطالعه، جهت بررسی اثر Nkx2.2^IVT در القاء تمایز به سلول­های اولیگودندروسیت، سلول‌های mNSC توسط Nkx2.2^IVT ترانسفکت شدند.  بعلاوه جهت مقایسه اثر توام آن با سایر فاکتورهای رونویسی مهم در القاء تمایز به رده اولیگودندروسیتی، Olig2^IVT و Sox10^IVT نیز بکار برده شدند و اثر ترکیبی آن‌ها همراه با Nkx2.2^IVT نیز ارزیابی شد. بدین منظور سلول‌های mNSC در حالت‌های مختلف از جمله تک‌سلولی چسبیده و سوسپانس (adherent and suspended single cell)، و نوروسفیر چسبیده و سوسپانس (adherent and suspended neurospheres) ترانسفکت شدند.

نتایج: نتایج نشان داد که 41 درصد از سلول‌های mNSC ترانسفکت شده با Nkx2.2^IVT طی مدت 14 روز به اولیگودندروسیت‌های بالغ تمایز پیدا کردند. نکته قابل توجه دیگر اینکه اگر چه گروه ترانسفکت شده با Olig2^IVT+Sox10^IVT+Nkx2.2^IVT درصد بالاتری (65 درصد) از تمایز به سلول‌های اولیگودندروسیت را نشان می‌دهد اما همچنان درصد موفقیت Nkx2.2^IVT به تنهایی نیز قابل قبول است. همچنین ترانسفکشن با Nkx2.2^IVT علاوه بر القای تمایز به اولیگودندروسیت، باعث القای تمایز به نورون (36درصد) نیز شد.

نتیجه‌گیری: این مطالعه نشان می‌دهد که القای تمایز با استفاده از ترنسفکشن Nkx2.2^IVT، یکی از بهترین روش‌های القاء تمایز و تولید اولیگودندروسیت و نورون با هدف مصارف بالینی در آسیب‌های عصبی که نیاز همزمان به نورون و اولیگودندروسیت دارند، می‌باشد.

کلیدواژه: ژن‌درمانی، سلول‌درمانی، ivt-mmRNA، Nkx2.2، سلول بنیادی عصبی موشی، سلول پیش‌ساز اولیگودندروسیت، اولیگودندروسیت.

تاریخ دفاع: پاییز 1398