ساناز صدقی اصفهانی، کارشناسی ارشد رشته زیست‌شناسی گرایش سلولی و مولکولی، دکترکیانوش درمیانی

نام و نام خانوادگی:ساناز صدقی اصفهانی
عنوان پایان نامه: ارزیابی بیان آنتاگونیست گیرنده اینترلوکین یک انسانی نوترکیب در باکتری E. coli
رشته تحصیلی:زیست شناسی گرایش سلولی و مولکولی
مقطع تحصیلی: کارشناسی ارشد ناپیوسته
استاد راهنما:دکترکیانوش درمیانی

چکیده:

آنتاگونیست گیرنده اینترلوکین یک انسانی، به فرم نوترکیب پروتئین غيرگليكوزيله ای است که دارای 152 اسیدآمینه و یک باند دی سولفید درون زنجیره ای می باشد. IL-1RA که آنتاگونیست گیرنده IL-1 می باشد نقش کلیدی در جلوگیری از التهاب در مفاصل و بیماری های سیستمیک مانند آرتریت روماتوئید ایفا می‌کند. مشکل اصلی در تولید IL-1RA نوترکیب کمبود بازده تولید این پروتئین به صورت محلول و همچنین نیمه عمر کوتاه این پروتئین می‌باشد. تا به امروز مطالعات مختلفی جهت افزایش پایداری، فعالیت و همچنین اتصال قوی تر این آنتاگونیست به گیرنده هدف، انجام شده است. در این مطالعه پروتئین انسانیIL-1RA به صورت منفرد و همچنین با بیان همزمان Thioredoxin (TrxA) در سویه باکتری SHuffle بیان شد. استفاده از رویکرد بیان همزمان TrxA و سویه SHuffle بیان این پروتئین به فرم محلول را به طور موفقیت آمیزی افزایش داد. مطالعات ما نشان داد در پروژه پیش رو برای اولین بار بیان این پروتئین در سویه باکتریایی SHuffle مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت زیستی پروتئین تولید شده پس از تخلیص، با جبران افت زنده مانی سلول های فیبروبلاست موشیNIH3T3 که تحت تیمار با Lipopolysaccharide (LPS)قرار گرفته بودند اثبات شد. از آنجاییکه این پروتئین نوترکیب فعالیتی همتراز با نمونه دارویی Perkinra به عنوان نمونه استاندارد نشان داد، این مطالعه ثابت کرد کهhIL-1RA نوترکیب به طور موفقیت آمیز و زیست فعال در باکتری SHuffle تولید شده است و میتوان از آن برای بررسی سایر فعالیت های فیزیولوژیک این پروتئین که هنوز مورد مطالعه واقع نشده اند استفاده کرد.
مواد و روش ها:
در این طرح در نظر است که ابتدا یک نسخه از توالی کدکننده پروتئین IL-1RA همراه با برچست خالص سازی His-tag و جایگاه برش پروتئاز TEV بین آنها و از سوی دیگر یک نسخه از توالی برچسب محلول سازی TrxA در دو کاست جداگانه در یک و بیانی pET15b کلون شده و حامل هدف تحت عنوان حامل pET15b-IL-1RA/TrxA نام گذاری می‌شود. هدف اصلی از ساخت این حامل تولید IL-1RA به صورت محلول در گونه SHuffle باکتری E. coli و سپس خالص سازی آن می باشد. حامل به گونه ای طراحی می شود که پروتئین نوترکیب IL-1RA تولید شده دارای His-Tag -باشد که خالص سازی آن را به راحتی امکان پذیر  سازد. علاوه بر این حامل بیانی، جهت ساخت حامل بیانی کنترل، توالی کدکننده‌ی IL-1RA در حامل pET15b بدون برچسب محلول سازی TrxA نیز کلون می شود به صورتی که اثر احتمالی TrxA در افزایش بیان محلول پروتئین IL-1RA با نتایج حاصل از بیان این حامل در باکتری مقایسه گردد. پس از تولید پروتئین نوترکیب IL-1RA به صورت محلول به کمک بیان همزمان تیوردوکسین، برای بررسی فعالیت زیستی آن، پروتئین محلول به کمک روش FPLC نیز خالص سازی نهایی شده و سپس اثر بخشی پروتئین نوترکیب بر روی مهار تکثیر و زنده مانی سلولهای رده NIH3T3 با تکنیکMTS بررسی گردید.

نتایج و بحث:
در طرح حاضر پروتئین IL-1RA انسانی (hIL-1RA)به صورت موفقیت آمیز به طور محلول (هم به صورت بیان منفرد و هم با بیان هم زمان TrxA) در باکتریSHuffle تولید و به کمک برچسبHis-Tag تخلیص اولیه شد. همچنین این پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی FPLC نیز خالص سازی شد. در انتها برچسب تخلیص هیستیدین با کمک آنزیم پروتئاز TEV جدا گردید. جهت بررسی فعالیت زیستی پروتئین نوترکیب IL-1RA تولید شده در باکتری، از رده سلولی فیبروبلاست جنین موشیNIH3T3 استفاده شد. همچنین برای القا و تولید IL-1β توسط این سلول ها از LPS استفاده گردید. براساس نتایج بدست آمده با تکنیک MTS assay، در همه غلظت های بکار رفته از پروتئین نوترکیب hIL-1RA تولید شده به صورت کاملا قابل مقایسه با غلظت های یکسان داروی استاندارد، از افت زنده مانی سلول ها پس از تیمار با LPS جلوگیری شد. همچنین بررسی فعالیت زیستی پروتئین نوترکیبی که برچسب تخلیص هیستیدین از آن جدا نشده بود نیز نشان داد که فعالیت آن با پروتئین فاقد برچسب تخلیص تفاوت معنی داری ندارد. از آنجاییکه این پروتئین نوترکیب فعالیتی همتراز با نمونه دارویی به عنوان نمونه استاندارد نشان داد، این مطالعه ثابت کرد کهhIL-1RA نوترکیب به طور موفقیت آمیز و زیست فعال در باکتری تولید شده است و می توان از آن برای بررسی سایر فعالیت های فیزیولوژیک این پروتئین که هنوز مورد مطالعه واقع نشده اند استفاده کرد.
نتیجه گیری: در این مطالعه، یک روش کارآمد برای تولید پروتئین hIL-1RAنوترکیب به فرم محلول و فعال در سلول-های باکتریایی سویه SHuffle ارائه شد که در آن پروتئین تولیدی در نهایت با یک روش مقرون به صرفه با برچسب حلالیت هیستیدین و با استفاده از رزین نیکل از سلول های باکتریای خالص سازی شد و در ادامه فعالیت زیستی آن در سلولهای NIH3T3 ثابت گردید.

کلیدواژه: آنتاگونیست گیرنده اینترلوکین یک(hIL-1RA)، پروتئاز TEV، سویه بیانی ,SHuffle .Thioredoxin