نام و نام خانوادگی:منا شوکتیان
عنوان پایان نامه: ساخت یک حامل minicircle مبتنی برRNAی تکثیر شونده ی ویروس Sindbis جهت بیان سریع و بالای EGFP در سلول های HEK293T
رشته تحصیلی:زیست شناسی گرایش سلولی و مولکولی
مقطع تحصیلی: کارشناسی ارشد ناپیوسته
استاد راهنما:دکترکیانوش درمیانی
چکیده:
تولید پروتئین های برون تنی با کاربردهای مختلف نظیر ساخت واکسن و تمایزسلولی در سلول هدف به چندین روش امکان پذیر است. در این میان رونویسی درون آزمایشگاهی و استفاده از mRNAهایی که با این روش تولید شده اند دارای محدودیت هایی است. لذا در این مطالعه هدف ما استفاده از روشی جایگزین در تولید سریع و انبوه mRNA با قابلیت تکثیر در سلول های هدف می باشد. ویروس سیندبیس متعلق به خانواده ی آلفاویروس ها و دارای RNAژنومی با قابلیت تکثیر می باشد که در توالی آن نواحی کدکننده ی پروتئین های ساختاری و غیر ساختاری وجود دارد. توالی کدکننده ی پروتئین های غیر ساختاری یک آنزیم همانندسازی با قابلیت تکثیر RNA ژنومی را کد می کند که این آنزیم همچنین می تواند از توالی تحت پروموتر ساب ژنومی موجود در پایین دست توالی کدکننده این آنزیم، میزان بسیار زیادی mRNA رونویسی کند. توالی های تحت پروموتر ساب ژنومی، کدکننده ی پروتئین های ساختاری مورد نیاز در فرآیند بسته بندی، اجتماع و جوانه زنی ذره ی ویروسی است که در وکتورهای مورد استفاده با منشا این ویروس در مطالعات گوناگون با توالی ژن مورد نظر جایگزین شده است که در این تحقیق جهت سنجش کارایی این سیستم با توالی ژن EGFP جایگزین شده است. لذا در این مطالعه با بهره گیری از آنزیم RNAرپلیکاز این ویروس، mRNA و در نتیجه پروتئین مورد نظر به میزان انبوه در سلول هدف تولید گردد. حامل به کاررفته جهت انتقال سیستم بیانی ویروس سیندبیس به سلول حامل مینی سیرکل نام داشته که یک حامل یوکاریوتی مبتنی بر DNA می باشد که در ژنوم میزبان الحاق نشده و طی تقسیمات سلولی از بین می رود. برای ساخت این مینی سیرکل قطعه ای شامل توالی رپلیکاز سیندبیس، پروموتر ساب ژنومی و ژن EGFP بین دو توالی attB و attP در پلاسمیدوالدی TDH کلون شده و طی فرآیند القا مینی سیرکل CMV-SinRep5-EGFP تولید شد. هم چنین کارایی سیستم و ماندگاری این مینی سیرکل در سلول در مقایسه با مینی سیرکل کنترل مثبت CMV-EGFP سنجیده شد. نتایج حاصل از تکنیک فلوسایتومتری و تصاویر میکروسکوپ فلورسنت، بیان بالای EGFP توسط سیستم رپلیکاز و ماندگاری کوتاه مدت مینی سیرکل در سلول های HEK293T را اثبات کرد.
کلیدواژه: آلفاویروس ، پروموتر ساب ژنومی، minicircle، RNA خودتکثیرشونده ، RNAرپلیکاز