نام و نام خانوادگی:هنگامه تقیان دینانی
عنوان پایان نامه: بررسی بیان پروتئین های خانواده Ten-Eleven Translocation (TET1-3) و وضعیت متیلاسیونDNA در بیضه ی رت های القاء شده واریکوسل
رشته تحصیلی:زیست شناسی گرایش سلولی و مولکولی
مقطع تحصیلی: کارشناسی ارشد ناپیوسته
استاد راهنما اول: دکتر مرضیه تولائی
استاد راهنما دوم:دکتر محمدحسین نصر اصفهانی
چکیده:
واریکوسل به بزرگ شدن وریدهای شبکه سیاهرگی پامپینی فورم درون کیسه بیضه گفته می شود. به دنبال ایجاد واریکوسل شرایطی از جمله تجمع جریان خون، هیپوکسی، هایپرترمی، عدم تعادل هورمونی، استرس اکسیداتیو در بیضه ایجاد می شود. افراد نابارور مبتلا به واریکوسل با افزایش دمای بیضه و استرس اکسیداتیو مواجه هستند که این استرس اکسیداتیو می تواند منجر به آسیب DNA و به دنبال آن تغییرات اپی ژنتیکی از جمله متیلاسیون DNA شود.کروماتین سلول اسپرم بسیار متراکم است و میزان متیلاسیون DNAدر این سلول بالا است. با ورود اسپرم به داخل تخمک، کروماتین از حالت تراکم خارج شده و دمتیلاسیون DNA رخ می دهد. آنزیم هایی که نقش در فرایند دمتیلاسیون فعال DNA دارند تحت عنوان Ten-Eleven Translocation (TET1-3)می باشند. عدم بیان هرکدام از این آنزیم ها در اسپرم می تواند با نقص در فرایند دمتیلاسیون فعال DNA پس از ورود اسپرم به داخل تخمک همراه باشد و به دنبال آن با کاهش تکوین و تکامل مرتبط باشد. همچنین بیان این آنزیم ها با تراکم کروماتین و تحرک اسپرم ارتباط مستقیم دارد. مطالعات متعددی نشان داده اند که ارتباط معنی داری بین سطح استرس اکسیداتیو و فعالیت آنزیم ها وجود دارد. در این راستا پیشنهاد شده است که فعالیت آنزیم های TET در شرایط استرس اکسیداتیو کاهش می یابد، به دنبال آن سطح دمتیلاسیون فعال DNA کاهش می یابد و هیدروکسی متیل سیتوزین رخ نمی دهد(5-hmC).
هدف: با توجه به اینکه ثابت شده است که در شرایط واریکوسل، استرس دمایی و به دنبال آن سطح استرس اکسیداتیو بطور معنی داری بالا است، در این مطالعه سعی بر آن است که بیان آنزیم های TET در بیضه رت های القاء شده واریکوسل مورد ارزیابی قرار گیرد.
روش اجرا: این مطالعه بر روی30 حیوان آزمایشگاهی رت نر، نژاد wistar انجام شد. رت های نر بطور تصادفی در 3 گروه کنترل، شم و واریکوسل طبقه بندی شدند.
2ماه پس از القاء واریکوسل رت ها قربانی شده و از بیضه چپ ( به دلیل ساختار آناتومیکی متفاوت و اینکه شیوع واریکوسل در آن بیشتر است) برای بررسی پروتئین های خانواده (TET1-3) TETاز روش وسترن بلات و ایمنوهیستوشیمی و برای بررسی5-hmC از روش ایمنوهیستوشیمی استفاده شد. برای بررسی بیان mRNA TETs نیز از روش Real time استفاده شد. همچنین با گرفتن مقاطع بافت بیضه، با استفاده از روش ایمنوهیستوشیمی، وضعیت متیلاسیون DNA مورد بررسی قرار گرفت. از اسپرم اپیدیدیم سمت چپ برای بررسی پارامترهای اسپرمی،کروماتین اسپرم (هیستون و پروتامین) و ROS استفاده شد.
نتایج: در سطح سلولی، القاء واریکوسل پس از 2 ماه منجر به کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی) و آسیب سلامت DNA ( آسیبDNA ، کمبود کروماتین، هیستون اضافه) و لیپید پراکسیداسیون گروه واریکوسل در مقایسه با دو گروه کنترل و شم شده است(05/0P<). همچنین واریکوسل باعث افزایش معنی دار5-hmC و کاهش معنی دار 5-mC در گروه واریکوسل در مقایسه با گروه کنترل-شم می گردد. در سطح مولکولی، القاء واریکوسل پس از 2 ماه منجر به افزایش معنی دار بیان TET2هم در سطح پروتئین و هم در سطح mRNA در گروه واریکوسل در مقایسه با گروه کنترل-شم گردیده است. در بیان TET1,TET3 در سطح mRNA در دو گروه کنترل-شم و واریکوسل تغییر معنی داری مشاهده نگردید، همچنین در سطح پروتئین با توجه به تکرار مکرر وسترن بلات با غلظت های مختلف آنتی بادی و پروتئین هیچ باندی برای این دو آنزیم مشاهده نشد.
نتیجه گیری: القاء واریکوسل منجر به کاهش متیلاسیون DNA و افزایش دمتیلاسیون DNA با افزایش بیان برخی از آنزیم های TET در بیضه رت ها می گردد و پیامد آن کاهش کیفیت اسپرم و همچنین کاهش تست های عملکردی اسپرم می باشد.
کلیدواژه: واریکوسل، پروتئین های TETs ، متیلاسیون DNA،5-hmC FNDC5، miR-129-5P